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Principes et méthodes du génotypage

génotypage : vers une lecture des marqueurs génétiques

Principes et méthodes du génotypage

génotypage

La sélection génomique repose sur l’estimation de la valeur génétique d’un animal à partir de son profil de marqueurs SNP. La méthode repose sur l’établissement d’une formule de prédiction de la valeur génétique à partir d’une population de références de plusieurs milliers d’individus  à la fois génotypés et phénotypés. Le procédé repose sur l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons sanguins. L’ensemble de la chaîne d’analyse menée dans des laboratoires d’analyse génétique pour les espèces animales, est robotisée. L’ADN est préparé puis distribué sur une puce sur laquelle, à l’aide de réactifs fluorescents, un scanner permet la lecture des marqueurs génétiques. 

Les principales étapes du génotypage

Extraction et purification de l’ADN

On peut extraire de l’ADN à partir de n’importe quel tissu de l’animal. Le tissu le plus souvent utilisé comme source d’ADN est le sang, mais on peut également utiliser du cartilage, des poils, du sperme etc. Le sang est facile à obtenir sans opération invasive et garantit une grande quantité d’ADN par rapport aux autres sources.Cela consiste à effectuer une lyse des cellules dans un premier temps, à éliminer les protéines et autres acides nucléiques (ARN), par des réactifs de lavage. Pour finir on concentre l’ADN en le précipitant dans l’alcool. La « méduse » est alors ce précicipé blanchâtre, translucide et filamenteux constitué de longs filaments d’ADN précipité.

Fragmentation de l’ADN

Les méthodes d’analyse ne permettent pas d’appréhender la totalité  de l’ADN d’une cellule. En effet, l’ADN d’une cellule contient près de 3 milliards  de bases chez les mammifères, soit une longueur d’environ 1,8 m ! C’est pourquoi le génotypage cherche à analyser des régions ou des fragments de quelques centaines de milliers de bases. On « fragmente » alors l’ADN grâce à des enzymes de restriction, par fragmentation mécanique ou par irradiation. 

La multiplication de l’ADN

La quantité d’ADN peut être un facteur limitant de la fiabilité des résultats. Si on s’intéresse à un fragment particulier du génome, il existe plusieurs possibilités pour l’ « amplifier ». On utilise alors la méthode de la PCR (polymérase chain reaction) qui se compose de trois étapes :

  • La dénaturation des deux brins d’ADN qui consiste à les séparer en deux brins simples, souvent par chauffage.
  • Chaque brin peut se rapparier avec son brin complémentaire ou un brin complémentaire exogène (selon la complémentarité des bases). Ce phénomène s’appelle l’hybridation. 
  • Puis se produit l’élongation, qui correspond à la synthèse des brins complémentaires par une polymérase, enzymes qui ont pour rôle la synthèse des brins de nucléotides.

Par ce procédé de PCR, à chaque cycle, il y a doublement du nombre de copies du fragment amplifié.

La séparation de l’ADN

On sépare les différents fragments, par électrophorèse,  pour les visualiser et les étudier individuellement. 

Le repérage

Plusieurs méthodes sont disponibles pour révéler des fragments d’ADN

  • coloration de l’ADN pour révéler les fragments après leur séparation
  • marquage au préalable les fragments d’ADN par des fluorochromes
  • hybridation du fragment à séquencer sur des oligonucléotides
     

La puce à ADN, l'ultime étape

Les puces à ADN ont été conçues en utilisant le phénomène d’hybridation des brins complémentaires de l’ADN. Des fragments d’ADN monobrin dont la séquence est connue avec présence de marqueurs génétiques sont déposés et fixés de façon ordonnée sur des lames de verre ou de silicium. Le dépôt est effectué sous forme de microgouttes par un robot dans des « micropuits ». Les fragments ainsi déposés constituent la sonde. Selon les besoins d’analyse des puces concernées, des centaines, voire des milliers ou des millions, de fragments spécifiques peuvent être fixés sur le support de la puce. La plus utilisée est la puce illuminée qui compte 54 000 marqueurs. Ces brins préalablement fixés sont susceptibles de s’apparier par hybridation avec des brins contenus dans l’échantillon de fragments à analyser, appelée la cible. Les brins de la cible sont marqués selon l’analyse que l’on veut en faire : seuls les brins portant la séquence complémentaire présente dans la cible pourront s’hybrider et les brins ne contenant pas les séquences recherchées sont éliminées par lavage avant lecture des puces. La fluorescence des brins hybridés permet d’attester de la présence de telle ou telle séquence et par conséquent de tel ou tel allèle des marqueurs de l’échantillon cible. 

Lecture d’une puce au scanner à fluorescence

L’échantillon passe dans un scanner qui fait alors apparaitre à l’écran des points de fluorescence. Chaque point de fluorescence correspond à un marqueur. Chaque marqueur lit la forme (a ou b) de chaque chromosome d’origine paternelle et d’origine maternelle. La couleur indique par conséquent si l’individu est homozygote (2 allèles identiques) ou hétérozygote (2 allèles différents) pour ce marqueur. 

 

 génotypage

Source image : http://www.transcriptome.ens.fr

 

Sélection génétique

Quels en sont les critères ?

  • Longévité des vaches laitières
  • Résistance aux mammites
  • Fertilité et les conditions de vêlage
  • Morphologie et rusticité
  • Baisse des anomalies génétiques

génotypage

  • génotypage

  • 5.1 millions d'IAT sont faites avec des taureaux de races laitières

  • Le génotypage et la sélection génomique ne sont qu’une simple lecture de l’ADN et une interprétation du potentiel génétique de l’animal. Il n’y a aucune manipulation ou modification des gènes de l’animal.